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MTT/噻唑藍 細胞增殖 細胞活性 藥物篩選

 簡要介紹：

MTT商品名噻唑藍，是一種黃顏色的染料。MTT主要用途：

1．藥物（或其他處理方式）對體外培養(yǎng)的細胞活性的測定；

2．細胞增殖及細胞活性測定。

MTT廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的藥物篩選、細胞活性試驗以及腫瘤敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟實惠。

貨號：CT-MTT-1

包裝量：1.0克MTT粉末

儲存：+4°C，避光

MTT全稱為3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，漢語化學名為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍，是一種黃顏色的染料。在水中的溶解度為20 mM。

技術資料：

CAS No：298-93-1

分子量：414.32

分子式：C18H16N5SBr

純度：>98%

MTT主要有兩個用途：

1．藥物（或其他處理方式）對體外培養(yǎng)的細胞活性的測定；

2．細胞增殖及細胞活性測定。

MTT實驗的原理：

細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臢（Formazan），并沉積在細胞中，而死細胞不能進行這個反應。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲臢，用酶標儀在570 nm波長處(490 nm -570 nm之間都可以）測定其光吸收值，在一定細胞數(shù)范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。根據測得的吸光度值（OD值）來判斷活細胞數(shù)量，OD值越大，細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越�。�。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的藥物篩選、細胞活性試驗以及腫瘤敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟實惠。

MTT實驗方法（供參考）

一、MTT的配制

通常配制的MTT濃度為5 mg/ml�？梢苑Q取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸鹽緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22 μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃ 避光保存，兩周內用完。也可分裝后避光保存在-20℃長期保存，并避免反復凍融。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。

二、實驗步驟

A、貼壁細胞

1、收集對數(shù)期細胞，調整細胞懸液濃度，向96孔板每孔加入100ul鋪板，調節(jié)待測細胞密度使每孔含1000-10000個細胞，邊緣孔用無菌水或PBS填充。

2、在5%CO2，37℃條件下孵育。原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，或過夜。一般常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般設5-7個藥物梯度，每孔100ul，一般設3個復孔即可，復孔越多結果越準確。同時設置調零孔（僅含培養(yǎng)基和藥物溶解介質）和對照孔（僅含細胞和藥物溶解介質）。

3、置于5%CO2，37℃條件下，孵育時間根據藥物的作用特點來決定，一般24-72小時，中途可在倒置顯微鏡下觀察細胞狀況。

4、每孔加入20ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），37℃繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時。若藥物能夠與MTT反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS洗2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液。

6、每孔加入150 ul DMSO，置搖床上低速振蕩10分鐘，使結晶物充分溶解。在570nm（可用630nm校準）測量各孔的吸光值。

B、懸浮細胞

1、收集對數(shù)期細胞，調節(jié)細胞懸液濃度1E6/ml，依次將①細胞懸液50ul（即5E4cell/孔），②待檢測藥物50ul，共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水或PBS填充）。一般設5-7個藥物梯度，一般設3個復孔即可，復孔越多結果越準確。同時設置調零孔（僅含培養(yǎng)基和藥物溶解介質）和對照孔（僅含細胞和藥物溶解介質）。

2、置于5% CO2，37 ℃條件下，孵育時間根據藥物的作用特點來決定，一般24-72小時，中途可在倒置顯微鏡下觀察細胞狀況。

3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），37℃繼續(xù)培養(yǎng)3-4 h。

4、離心（1000轉x10 min），小心吸掉上清，每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在570 nm（可用630 nm校準）測量各孔的吸光值。

注意事項

1、MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞絕對數(shù)。在用酶標儀檢測結果的時候，為保證實驗結果的準確，MTT 吸光值要控制在儀器的線性讀取范圍內。

2、MTT最好現(xiàn)用現(xiàn)配，配制成5 mg/ml無菌過濾后，在4 ℃避光保存兩周內有效，或在-20℃長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光，以免分解。

3、保存的MTT溶液需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，不放心的話可以把操作臺上的照明燈關掉。

4、配制MTT時用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，可用60 ℃水浴助溶。

5、MTT的缺點：由于MTT經還原所產生的甲臢產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲臢的有機溶劑對實驗者也有損害。

6、MTT有致癌性，用的時候小心，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作，最好戴透明的薄膜PE手套。

7、本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究使用。