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一、靈芝菌絲體被成為“靈芝胎盤”，由靈芝孢子萌發(fā)形成菌絲(靈芝菌絲不斷地分解，吸收養(yǎng)份，在合適的光照，空氣，溫度等其它條件配合時(shí)就形成了靈芝子實(shí)體。子實(shí)體成熟后彈射孢子粉，也就形成了靈芝的生活史，靈芝子實(shí)體所需要的構(gòu)成物質(zhì)，有一半以上的營養(yǎng)物質(zhì)來源于菌絲體中的貯存養(yǎng)份)，靈芝菌粉具有靈芝相同的有效成分，其中粗多糖及靈芝多糖和蛋白質(zhì)的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于天然靈芝，該品及相關(guān)制劑可寧心安神、健脾和胃。用于失眠健忘、身體虛弱、神經(jīng)衰弱等。靈芝菌絲發(fā)酵粉，輔助治療效果較靈芝、靈芝粉要好，有時(shí)作用效果和破壁靈芝孢子粉差不多。靈芝菌發(fā)酵菌絲體，烘干粉碎，價(jià)格優(yōu)惠質(zhì)量好。

二、靈芝菌粉發(fā)酵工藝：

　靈芝是我國古代勞動(dòng)人民用之已久的一類珍貴的藥用真菌，具有補(bǔ)中、固腎、補(bǔ)肺、止血的 功 用，對(duì)多種慢性病有一定療效。靈芝多糖對(duì)肉瘤 s180、腫瘤 ah-b，埃利希氏腹水 瘤及腺瘤具有明顯的抑制活性，并能迅速恢復(fù)和提高機(jī)體免疫能力，治療愛滋病的報(bào)道更引 人矚目，掀起了一場(chǎng)“靈芝研究熱”［1］。

　　靈芝及其多糖廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域，市場(chǎng)需求量與日俱增，但目前靈芝多糖的生產(chǎn) 幾乎都是從子實(shí)體中提取，靈芝野生資源缺乏，人工栽培的周期長(2～3個(gè)月以上)，占地面 積大，又受季節(jié)限制，從而影響了靈芝的充分利用，而利用深層培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)靈芝，周期短 (7～10 d)、成本低、產(chǎn)量大，具有工業(yè)化的生產(chǎn)前景，選取合適的培養(yǎng)基、適當(dāng)?shù)姆蛛x純 化方法，提取靈芝多糖是本研究的終目的。我們對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及靈芝多糖提取的工藝 進(jìn)行了深入研究，不僅多糖獲得了分級(jí)分離，而且對(duì)多糖組成成分也進(jìn)行了分析。

　　1　靈芝培養(yǎng)基的優(yōu)化

　　1.1　菌株：紫芝 g989菌株由中國輕工食品發(fā)酵研究所提供。

　　1.2　優(yōu)化培養(yǎng)基的篩選：將保存的菌種從4 ℃的冰箱中取出，在28 ℃下活化，然后在 無菌操作臺(tái)上用接種針將母種接至pda培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中(28 ℃以下)培養(yǎng)1 周。然后 將其接種至種子培養(yǎng)基中，放置于搖床上(28 ℃，120 r/min)發(fā)酵1 周。下?lián)u床后，將種子 接到正交實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中發(fā)酵1 周(見表1)。

表1　正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基

瓶號(hào) 碳源 氮源 起始

　　ph值
菌絲體

　　干重(g)
粗多糖

　　干重(g)

1# 3.6%葡萄糖 0.4%蛋白胨 5.0 1.562 0 0.071 9
2# 3.6%葡萄糖 0.4%黃豆粉 6.0 1.020 2 0.057 2
3# 3.6%葡萄糖 0.4%硫酸銨 7.0 0.460 3 0.016 4
4# 3.6%蔗糖 0.4%蛋白胨 6.0 0.599 8 0.006 7
5# 3.6%蔗糖 0.4%黃豆粉 7.0 0.489 3 0.039 8
6# 3.6%蔗糖 0.4%硫酸銨 5.0 0.387 3 0.019 9
7# 3.6%麥芽糖 0.4%蛋白胨 7.0 1.358 3 0.044 2
8# 3.6%麥芽糖 0.4%黃豆粉 5.0 1.274 1 0.047 6
9# 3.6%麥芽糖 0.4%硫酸銨 6.0 0.572 9 0.047 1

　　接種量：8 毫升/瓶；搖床轉(zhuǎn)速：120 r/min；溫度：28 ℃；其余成分：kh2po4 0.1% ，vit b1 0.005%，mgso4*7h2o 0.05%。

　　將 1 周后的發(fā)酵液離心(20 ℃，3 000 r/min)10 min，離心后的上清液在水浴鍋中濃縮 (60 ℃)，濃縮液中加入等體積 85% 工業(yè)酒精沉淀，放置于冰箱中過夜。然后將濃縮液 離心(20 ℃，3 800 r/min)，將離心的沉淀物放置于烘箱中(80 ℃以下)， 烘干并稱重，即得 胞外粗多糖產(chǎn)量。離心后得到的菌絲體放置于烘箱中(80 ℃以下)烘干，稱重。

　　1.3　發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定：利用 dns 法測(cè)定發(fā)酵液中還原糖的變化［3］，利用蒽酮法 測(cè)定發(fā)酵液中總糖的變化［4］；利用甲醛滴定法測(cè)定發(fā)酵液中氨基氮的變化［ 5］；以及利用 ph 計(jì)測(cè)定發(fā)酵液中 ph 值的變化。

　　1.4　靈芝的菌絲體形態(tài)：本實(shí)驗(yàn)用 h-800 透射電鏡對(duì)靈芝菌絲體的形態(tài)進(jìn)行觀察(如圖1 所示)，靈芝菌絲體長勢(shì)茂盛，菌絲很飽滿。

圖1　靈芝菌絲體電鏡照片

　　1.5　靈芝胞外多糖的提取分離純化：將依前述方法得到的粗多糖加熱水溶解，然后趁熱真空抽濾，濾液冷卻后加入氯仿與正丁醇 以 4∶1 混合液，攪拌，再離心，離心后取上層多糖水溶液加入活性炭脫色，過濾的清液用 85% 工業(yè)酒精沉淀，然后用丙酮，無水乙醇依次洗滌，在真空干燥器中干燥得總多糖。

　　1.6　多糖組分分析［6］：sephadex g-200 柱層析，流速 0.5 ml/min，洗脫劑 為 0.5 mol/l nacl 溶液，多糖用蒽酮法檢測(cè)。

　　1.7　多糖組成分析：裁剪 10 cm×23 cm 的新華濾紙，在濾紙的底端 3 cm 處用鉛筆劃線 作為樣品的起點(diǎn)線，用毛細(xì)管分別吸取待測(cè)樣品及葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、甘露糖等 單糖溶液，在樣品的起點(diǎn)線上每隔 2 cm 點(diǎn)一個(gè)樣，將點(diǎn)好樣品的濾紙懸掛在盛有乙酸乙酯 -水-吡啶(60∶20∶25)展層劑的層析缸中，密閉層析缸飽和，然后將其底部浸入展層，用 苯胺-二苯胺系統(tǒng)顯色(即苯胺 4 g，二苯胺 4 ml,85%的磷酸 70 ml)，用吹風(fēng)機(jī)吹干后， 放置于烘箱中，105 ℃ 烘烤 5 min。其中待測(cè)樣品是粉碎后溶于 1 mol/l 硫酸中，封管 ，然后在沸水浴中水解 6 h，加入 baco3，中和硫酸后過濾即得。

　　2　結(jié)果與討論

　　2.1　優(yōu)培養(yǎng)基的篩選：根據(jù)對(duì)正交實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基發(fā)酵所得到的粗多糖及菌絲體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析，得出氮源是主要因素，碳源其次，ph 值影響小，并且由于黃豆粉中含糖，影響發(fā)酵 參數(shù)的測(cè)定，而較酸的環(huán)境也不利于微生物的生長。故后確定的較優(yōu)化的組合為：碳源為 葡萄糖3.6%，氮源為蛋白胨0.4%，ph值 6.0，酵母膏 0.2%，kh2po4 0.1%，mgso 4*7h2o 0.05%，vit b10.005%。每升發(fā)酵液產(chǎn)干菌絲體 15.6 g，粗多糖產(chǎn)量達(dá) 37.5 g /kg 干菌體。

　　2.2　發(fā)酵過程中參數(shù)的變化：通過跟蹤測(cè)定發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中還原糖逐漸減少，這是因?yàn)殪` 芝在不斷地利用還原糖(即葡萄糖)，到發(fā)酵終點(diǎn)，葡萄糖幾乎全被利用完�？偺侵皇窃跇O小 的范圍內(nèi)波動(dòng)，即雖然還原糖被不斷消耗了，但還原糖又被轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌奶穷悾偺呛渴?終不變；氨基氮先是在很小范圍內(nèi)變化，然后逐漸降低，因?yàn)閯傞_始靈芝生長緩慢，蛋白質(zhì) 的生成與消耗幾乎持平，隨后靈芝生長旺盛，蛋白質(zhì)呈逐漸下降趨勢(shì)；ph 值是不斷降低的 ，說明在發(fā)酵中有酸類物質(zhì)分泌到胞外，即靈芝酸。

　　2.3　胞外多糖的分離純化：通過紫外分析可知，我們所得到的靈芝多糖在260 mm及280 mm 處無吸收峰，也就是說無核酸及蛋白質(zhì)存在，基本上證明多糖無其他雜質(zhì)，且通過發(fā)酵得到 的多糖提取得率為37.5 g/kg干菌體，比文獻(xiàn)報(bào)道［2］34.4 g/kg干菌體有提 高。

　　2.4　胞外多糖組分的層析分析：通過凝膠層析所得到的洗脫曲線見圖2。

圖2　胞外多糖的洗脫曲線

　　從圖2可以看出，胞外多糖的成分復(fù)雜，分子量大小不一，共有 5 個(gè)組分。

　　2.5　多糖的單糖組成分析：

　　2.5.1　紙層析：通過紙層析測(cè)定 rf 值與已知單糖比較可知靈芝胞外多糖組分是由葡萄 糖、甘露糖、果糖組成的。

　　2.5.2　胞外多糖紅外分析：通過胞外多糖紅外光譜看出 840 cm-1及 761 cm -1 附近無吸收峰，892 cm-1 處有吸收峰，表明靈芝胞外多糖具有 β-d -糖苷鍵 ；800 cm-1 處有一微弱的吸收峰表明有甘露糖存在；1 110 cm-1 處有吸 收表 明靈芝多糖的單糖為六元環(huán)結(jié)構(gòu)；3 400 cm-1 處的強(qiáng)吸收峰為糖分子中締 三羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰。

　　2.5.3　氣相色譜分析：將胞外多糖組分 1 的酸水解液乙酰化后作氣相色譜，其結(jié)果如表 2 所示。乙酰化方法是：取 20 mg 靈芝多糖溶于 3 ml 5 mol/l 硫酸中，封管在沸水中 水解 8 h，水解液加入適量 baco3 中和，過濾。濾液中加入 15 mg nabh4，放置過夜 ，然后加入適量乙酸分解過量的 nabh4，重復(fù) 4 次。將上面得到的溶液在 105 ℃ 的 烘箱中烘干，冷卻后轉(zhuǎn)入真空耳塞管，加入 1 ml 乙酸酐，0.5 ml 吡啶，然后在 100 ℃ 下反應(yīng) 2 h，反應(yīng)液冷卻后加入 1 ml 水，放入表面皿中蒸發(fā)至干。后用 1 ml 氯甲烷提 取，提取液可直接進(jìn)行氣相色譜分析(見表2)。

表2　胞外多糖的氣相色譜分析

保留時(shí)間

　　(min)
峰面積 含量

　　(%)
校正因子
3.232 3973 5.214 1.000e+000
3.813 219 0.287 1.000e+000
4.250 615 0.807 1.000e+000
5.548 71389 93.691 1.000e+000
合計(jì) 76196 100.00

　　從表2我們可以看出，靈芝胞外多糖組分1是由3種單糖組成的，結(jié)合紙層析的結(jié)果可知靈芝 胞外多糖中含有甘露糖、果糖、葡萄糖，其中果糖是首次報(bào)道。address: sun dongping, college of chemical engineering, nanjing university of tech nology, nanjing

　　孫東平　男，1970年生，江蘇灌云人，現(xiàn)為南京理工大學(xué)化工學(xué)院博士研究生，講師，主要 從事糖化學(xué)及微生物生理、生化研究工作，發(fā)表學(xué)術(shù)論文多篇，參與國家自然科學(xué)基金等多 項(xiàng)科研工作。

參 考 文 獻(xiàn)

　　1，黃為群，吳其威，黃瑞珊，等.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，28(2)：83

　　2，羅立新，姚汝華，周少奇.食品工業(yè)科技，1998，(3)：6

　　3，孫東平.液體發(fā)酵紅曲的應(yīng)用研究.南京大學(xué)碩士研究畢業(yè)論文，1997：19

　　4，袁玉蓀，朱婉華，陳鈞輝.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn).北京：高等教育出版社，1995：13

　　5，袁玉蓀，朱婉華，陳鈞輝.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn).北京：高等教育出版社，1995：65

　　6，張承圭，王傳懷，袁玉蓀，等.生物化學(xué)儀器分析.北京：高等教育出版社，19 90：203